二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)測試盒

商品詳情：
測定意義：

核酮糖-1,5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶(EC 4.1.1.39)是植物光合作用中的一個(gè)關(guān)鍵酶，既控制著(zhù)CO2的固定，同時(shí)又制約著(zhù)碳素向Calvin循環(huán)和光呼吸循環(huán)分流，其活性的大小直接影響著(zhù)光合速率。

測定原理：

在Rubisco的催化下，1分子的核酮糖-1，5-二磷酸(RuBP)與1分子的CO2結合，產(chǎn)生2分子的3-磷酸甘油酸(PGA)，PGA可通過(guò)外加的3-磷酸甘油酸激酶和甘油醛-3-磷酸脫氫酶的作用，產(chǎn)生甘油醛-3-磷酸，并使還原型輔酶I(NADH)氧化。因此，340nm吸光度的變化可計算還原型輔酶I氧化速率，還原型輔酶I氧化速率可反應Rubisco的活性。

需自備的儀器和用品：

分光光度計/酶標儀、臺式離心機、水浴鍋、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。
樣品中AA提取：

1.按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱(chēng)取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進(jìn)行室溫勻漿，然后轉移到1.5 mL EP 管中，蓋緊后（防止水分散失）置于沸水浴提取15 min；自來(lái)水冷卻后，8000g，，4℃離心10min，上清液置冰上待測。

2.細菌或培養細胞：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細菌或細胞數量（104個(gè)）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細菌或細胞加入1mL試劑一），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復30次）；8000g，4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

3.血清等液體：直接檢測。

計算公式如下：

1、血清（漿）LAP活力的計算:

單位的定義：每mL血清（漿）每分鐘生成1 nmol的對硝基苯胺定義為一個(gè)酶活力單位。

LAP（nmol/min/mL）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷V樣÷T=205.8×ΔA

2、組織、細菌或細胞中LAP活力的計算:

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘生成1 nmol 對硝基苯胺定義為一個(gè)酶活力單位。

LAP（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=205.8×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g組織每分鐘生成1 nmol 對硝基苯胺定義為一個(gè)酶活力單位。

LAP（nmol/min /g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T=205.8×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細菌或細胞每分鐘生成1 nmol 對硝基苯胺定義為一個(gè)酶活力單位。

LAP（nmol/min /104 cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(2000×V樣÷V樣總) ÷T=0.103×ΔA

V反總：反應體系總體積，2×10-4 L；ε：對硝基苯胺摩爾消光系數，9.72×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.05 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應時(shí)間，2 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；2000：細菌或細胞總數，2000萬(wàn)。

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注意事項：

1. 試劑盒中試劑三、試劑四和標準品均需臨用前配制，且避光保存，配制好未使用完的4℃保存且3天內使用完畢。

2. 為保證實(shí)驗結果的準確性，需先取1-2個(gè)樣做預實(shí)驗，如果測定的吸光值過(guò)高（高于2.5），用蒸餾水稀釋后再測定。

3. 與茚三酮反應在570nm處無(wú)吸收峰，因此，570nm處測定結果不含這兩種氨基酸的量。

4．檢出限為100μmol/L。