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結合態(tài)淀粉合成酶(GBSS)測試盒測定意義

GBSS(EC 2.4.1.21)以束縛態(tài)存在于淀粉體中，催化淀粉鏈的加長(cháng)反應，主要負責直鏈淀粉的合成。

測定原理

GBSS催化ADPG與淀粉引物(葡聚糖)反應,將葡萄糖分子轉移到淀粉引物上，同時(shí)生成ADP；進(jìn)一步通過(guò)反應體系中添加的酸激酶、己糖激酶和6-磷酸葡萄糖脫氫酶依次催化NADP+還原為NADPH，其中NADPH生成量與前一步反應生成的ADP數量呈正比，通過(guò)340nm下測定NADPH的增加量，可以計算GBSS活性。

需自備的的儀器和用品

紫外分光光度計/酶標儀、水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。
樣品中AA提取：

1.按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱(chēng)取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進(jìn)行室溫勻漿，然后轉移到1.5 mL EP 管中，蓋緊后（防止水分散失）置于沸水浴提取15 min；自來(lái)水冷卻后，8000g，，4℃離心10min，上清液置冰上待測。

2.細菌或培養細胞：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細菌或細胞數量（104個(gè)）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細菌或細胞加入1mL試劑一），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復30次）；8000g，4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

3.血清等液體：直接檢測。

計算公式如下：

1、血清（漿）LAP活力的計算:

單位的定義：每mL血清（漿）每分鐘生成1 nmol的對硝基苯胺定義為一個(gè)酶活力單位。

LAP（nmol/min/mL）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷V樣÷T=205.8×ΔA

2、組織、細菌或細胞中LAP活力的計算:

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘生成1 nmol 對硝基苯胺定義為一個(gè)酶活力單位。

LAP（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=205.8×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g組織每分鐘生成1 nmol 對硝基苯胺定義為一個(gè)酶活力單位。

LAP（nmol/min /g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T=205.8×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細菌或細胞每分鐘生成1 nmol 對硝基苯胺定義為一個(gè)酶活力單位。

LAP（nmol/min /104 cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(2000×V樣÷V樣總) ÷T=0.103×ΔA

V反總：反應體系總體積，2×10-4 L；ε：對硝基苯胺摩爾消光系數，9.72×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.05 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應時(shí)間，2 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；2000：細菌或細胞總數，2000萬(wàn)。

注意事項：

1. 試劑盒中試劑三、試劑四和標準品均需臨用前配制，且避光保存，配制好未使用完的4℃保存且3天內使用完畢。

2. 為保證實(shí)驗結果的準確性，需先取1-2個(gè)樣做預實(shí)驗，如果測定的吸光值過(guò)高（高于2.5），用蒸餾水稀釋后再測定。

3. 與茚三酮反應在570nm處無(wú)吸收峰，因此，570nm處測定結果不含這兩種氨基酸的量。

4．檢出限為100μmol/L。

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